<table id="bfmap"></table>

  • <source id="bfmap"><mark id="bfmap"></mark></source>
  • <b id="bfmap"><acronym id="bfmap"></acronym></b><table id="bfmap"><acronym id="bfmap"></acronym></table>

        <source id="bfmap"><track id="bfmap"><ins id="bfmap"></ins></track></source>
      1. 專注原料開發  提供優質服務

        en
        新聞資訊
        您當前的位置 : 首 頁 > 新聞資訊 > 技術資訊

        超詳細!qPCR擴增曲線異常結果分析

        2023-08-03 11:25:58

        文章來源:IVD學習筆記、百力格生物 

        作者:BiOligo


        在qPCR的實驗過程中,不論是“新手”還是“老手”或多或少都會遇到擴增曲線異常的情況,給結果判讀帶來很大的困擾。異常曲線的出現可能是單個的原因(這種情況通常對單一因素調整后就會變為正常),也有可能是多個原因綜合影響導致而成的,這時就需要仔細分析,控制變量進行重復驗證。


        對于異常曲線的分析在總結完異常曲線的特征之后,需要按照“人、機、料、法、環”的思路進行逐一排查,雖然說異常曲線的結果可能是“千奇百怪”,但是任何的結果仔細尋源后都可以找到其產生的原因,所以理清思路、具體原因具體分析是對異常結果判讀與解決的關鍵。


        以下是小編為大家整理的探針法qPCR常見問題,根據常見的問題結合應用實例供大家參考。


         儀器、耗材與配件問題 


        01

        使用普通PCR儀器所用耗材

        普通耗材一般透光度比較差,會造成熒光擴增曲線異常,比如打折的擴增曲線。


        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/23/08/6ed7d546321851f75576e4dc73f1e75a93e905c2.png


        02

        使用質量較差的耗材

        質量較差耗材可能會引起熒光值不穩定,這會造成反應孔的自動基線扣除錯誤,得到不準確的Ct值(上圖),更換質量好的耗材后,熒光信號正常(下圖)。



        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/23/08/8c67f1890936b58d097463cad8b0038fd917d44d.png

        03

        封膜質量不好

        如果96孔板封膜質量不好,在PCR過程中則會受到水蒸氣的影響,容易產生變形,會引起 “光學扭曲”現象(上圖),使用ROX作為參比染料,校正熒光信號變化后均一化的擴增曲線正常(下圖)。

        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/23/08/784fde485dc530f6d9b0e0f87f3a50d868d37b79.png

        04

        儀器不穩定-擴增曲線有向上或者向下的尖峰

        可能是電壓不穩或者是光源不穩導致熒光波動,如下圖所示。

        image.png


        05

        自動基線設置

        自動基線設置過高可能會出現擴增下降,如下圖所示??梢赃M行手動設置基線,將baseline end設置為“擴增信號出現的前一個循環”。

             


          反應體系-加樣問題  


        01 

        反應體系存在蒸發,水分丟失

        ROX 濃度會增加,ROX參比熒光上抬(上圖),而正??字蠷OX熒光會一直不變(下圖)。


        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/23/08/a9a33c751dff803b3ba80bfd1bac8fe9d4aa1e0d.png


        02

        反應體系存在嚴重蒸發—山域型曲線

        輕微的蒸發會是一種緩慢的上升,嚴重的蒸發會呈現先上升后下降的曲線,這兩類異常曲線可以通過觀察檢測后的反應管液面是否下降來區分。


        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/23/08/03123eac0bd52130985caaf708e636c15c242829.png


        03

        反應體系存在氣泡

        上機的反應體系里有大的氣泡,中間容易形成折射,干擾熒光的采集,如下圖所示。

        此外如果反應體系存在氣泡也有可能出現擴增曲線有向上或者向下的尖峰,和儀器問題的最大區別是存在氣泡是單一樣本偶發的,而儀器問題會出現一致的波動。

        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/23/08/198afde6c602087c08cf7965545ec5adbffd8f11.png


          反應體系-體系問題  


        01

        引探配比不當

        下圖1引探量過少,導致平臺期提前,熒光增量低;2、3為適宜引探量范圍,4引探量過高,導致擴增不徹底、無平臺期。


        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/23/08/f4cb2a6f47edbf9e58d87f6d3962ffaa8ec90089.png


        02

        酶量使用不當

        不同擴增重復數、不同模板質量或者擴增難度,對酶量的要求不一樣,酶量少會使擴增不徹底,終點熒光值低;酶量過多則會導致平臺期上揚。


        酶量不足擴增曲線

        image.png


        酶量過多擴增曲線

        image.png


        03

        dNTP量使用不當

        dNTP量過少或過多均會影響擴增效果。1~5號是dNTP量逐漸增多測試的擴增曲線圖,1~3號Ct值保持不變、熒光增量逐漸增大,3~5號Ct值逐漸變大、4號和5號擴增曲線線形變差,最適dNTP量為3號。


        image.png


        04

        存在擴增抑制劑

        可能是樣本本身存在過多抑制劑:結構蛋白、脂肪、多糖等,也有可能是模板提取試劑殘留:乙醇、蛋白酶K、苯酚等,如下圖H07擴增曲線存在擴增抑制,這種情況可以重新提取樣本或者將樣本稀釋后再擴增。


        image.png



          擴增曲線末尾起跳  


        末尾起跳可能有較多因素,包括:1)存在污染;2)非特異性擴增;3)樣本濃度低;4)酶特異性差,可以進行逐一排查。


        image.png



        無擴增曲線或無Ct值


        作為最常見的情況,如下圖所示,可能原因包括:1)PCR 參數設置錯誤:在設計循環參數時沒有設置熒光信號采集;2)模板降解 : 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融;2)引物或者探針降解:可通過 PAGE 電泳檢測其完整性;4)電腦設置了自動休眠。


        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/23/08/b0cf0e398b9757cecaacad7db5ad79113a74ce4f.png


        異常的曲線“千千萬萬”,但是追根溯源還是圍繞著“人、機、料、法、環”,按照可能原因進行一一核查,控制變量,重復驗證,獲得完美曲線并不難哦~



        標簽

        下一篇:簡介,數字PCR檢測技術2023-08-07

        近期瀏覽:

        相關產品

        相關新聞

        聯系我們

        0756-8699969

        地址:珠海市香洲區南屏科技工業園屏北一路333號1棟

        郵箱:marketing@biori.com.cn

        http://cdn.myxypt.com/05aa6382/21/09/10989b1b98bfafd88117d10d6907f678cd1033c1.jpg 

        微信公眾號

        image.png 

        試用申請

        網站導航

        關于寶銳         企業文化          發展歷程

        榮譽資質         產品中心          公司新聞

        行業熱點         員工風采          下載中心

        聯系我們       


        網站地圖 | 版權@2021 珠海寶銳生物科技有限公司 粵ICP備19103206號
        精产国品一二三区_亚洲国产日韩一区无码精品久久久_中国少妇精品久久久久无码AV_五月综合色

        <table id="bfmap"></table>

      2. <source id="bfmap"><mark id="bfmap"></mark></source>
      3. <b id="bfmap"><acronym id="bfmap"></acronym></b><table id="bfmap"><acronym id="bfmap"></acronym></table>

            <source id="bfmap"><track id="bfmap"><ins id="bfmap"></ins></track></source>