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        簡介,數字PCR檢測技術

        2023-08-07 11:16:12

        文章來源: IVD工具人

        文章作者:基因talks


        什么是dPCR?

        dPCR:數字PCR(Digital PCR,dPCR),通過將待測樣本進行極限稀釋,使每個反應室中平均只有一個拷貝或者沒有目標DNA分子,然后加入熒光信號進行PCR擴增,可以檢測到低至一個拷貝的突變。

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        dPCR檢測原理:

        數字PCR是一種核酸檢測和絕對定量的新方法。同傳統PCR以及qPCR相比,數字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作,將幾十微升的已經配好的包含有引物、模板、buffer、酶等組分的PCR反應體系分隔成了眾多微小的、獨立的反應體系,這樣能夠直接數出DNA分子的個數,對起始樣品絕對定量,通過將一個樣本分成幾萬到幾百萬份,分配到不同的反應單元,每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ,在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增,擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析,有熒光信號記為1,無熒光信號記為0(不同于qPCR 對每個循環進行實時熒光測定的方法,數字 PCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集)。



        在分配的過程中,引物、酶等組分過量,而模板則是不過量的。模板DNA分子隨機地進入到各個小的反應體系中,經過PCR擴增后,包含模板的體系完成擴增,不包含模板的體系無擴增(ddPCR的原理與熒光PCR的反應原理和是一樣的,可以設計TaqMan探針、分子信標探針或者采用染料法進行檢測,伯樂公司推薦使用BHQ1作為粹滅基因)。

        模板DNA分子進入各個小的反應體系的過程滿足泊松分布規律,因此,檢測擴增PCR產物的信號強度,帶入泊松分布公式計算,即可計算出起始模板DNA分子的拷貝數。(目前數字PCR有兩種分配技術原理,見下圖1和2)

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        超強的泊松統計:由于dPCR是一種終端分析法,如果目標分子沒有很好的離散化,如一些小室在結束時具有不止一個的靶標(比如說在一個液滴中同時出現了幾種突變的靶標,列如KRAS、EGFR、BRAF和TP53等),那么理論上結果得到的濃度可能就會棄之不用。這就是泊松統計發揮作用的地方。


        據Bio-Rad實驗室數字生物學中心科學事務部主任GeorgeKarlin-Neumann稱,泊松統計描述了一種隨機分布。只要小室沒有達到飽和,用戶就可以反算他們起始的分子數,即使一些孔中實際上容納了不止一個分子(這種情況在數字PCR中讀做單一計數)。只要你告訴我你有多少小室或者多少液滴,(并且)它們中多大比例呈陰性。它就會基本上告訴我初始的濃度,這也將告訴我陽性小室與陰性小室的比例。

        分子混合物被離散或分隔化到大量的反應室中(越多越好),這樣每個室中平均有一個或零個目標核苷酸。對每個區劃進行PCR反應后,使用泊松統計將陽性信號的計數轉換為一個絕對值。


        如果將這一過程比作一代測序(Sanger測序),在單個管中對100個模板分子的混合物(其中有一個是突變的)進行測序會產生一個電泳圖譜,其中在突變位點上的顯著信號會是野生型堿基。


        你甚至基本不會發現,在(信號峰)下存在著一個表示不同堿基讀取的小突起,因為它在整個分子混合物中的占比太低了。但將這些分子稀釋并將其分布在多重反應中,就能產生出99個野生型信號和一個明顯的突變信號,這就是數字的、絕對定量的結果,也是dPCR最大的優勢之處。


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        dPCR與qPCR比較



        數字PCR與傳統PCR技術不同,數字PCR采用絕對定量的方式,采用的策略簡單概括就是“分而治之”,類似于計算機科學中的“分治算法”,將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中,在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ,實現“單分子模板PCR擴增”,擴增結束后,通過陽性反應器的數目“數出”目標序列的拷貝數,特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。


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        數字PCR“分而治之”


        國家食品藥品監督管理總局對數字PCR的工作原理描述:對目標核酸序列定量和定性檢測,用聚合酶鏈式反應分析法,將具有熒光定量PCR的反應物(TaqMan探針法或SYBR綠色引物法)加載到芯片上,然后用dPCR擴增儀進行熱循環反應。芯片反應完成后放到dPCR分析儀上進行成像和分析,輸出原始數據,將原始數據放到云端的dPCR軟件上分析,并得到最終結果。儀器每處理一個芯片,只要一分鐘儀器就能讀完芯片。

        市場主流的數字PCR

        目前市場上主流數字PCR的是三家:

        1、Life Technologies 3D數字PCR(芯片式數字PCR):可認為是微孔數字PCR,主要是將20ul反應體系分散到20000個微孔中進行反應,變成20000個反應體系,PCR反應結束后,采用CCD拍照,數陽性反應孔。

        2、Bio-Rad 微滴數字PCR(油包水液滴式數字PCR):將20ul反應體系采用液滴反應器形成20000個油包水反應體系,PCR反應結束后,才有流式細胞術的原理,檢測每一個液體,數陽性反應的液滴數量。

        3、RainDance 的數字PCR(油包水液滴式數字PCR):原理與伯樂微滴數字PCR相同,但是其液體形成能力比伯樂強很多,理論上可以產生1000萬個小油滴。


        價格從高到底:分別是Raindance、Bio-Rad、Life Technologies。


        國內數字PCR的發展

        數字PCR曾在2013年被《麻省理工大學科技評論》評為十大突破技術之一,2017年入選《世界經濟論壇》評出的全球十大新興技術,經過幾年的發展,目前在國內的臨床分子檢測已經小規模得以運用。


        2015年,國家衛生計生委個體化醫學檢測技術專家委員會,在廣泛征求意見的基礎上,制訂了《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》,在此次《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》中,以QX200為技術代表的數字PCR技術,已經正式寫入進去。

        2016年4月,科維思在Thermo Fisher產品的基礎上,申請了核心耗材的發明專利,并申請了IVD類醫療器械審批的綠色通道:芯片式數字聚合酶鏈式反應(DPCR)分析系統。


        2017年7月27日,CFDA天津市市場和監督管理委員會已正式批準天津諾禾致源生物信息科技有限公司的數字PCR芯片閱讀儀——Digital PCR NG上市[ 津械注準 20172400198 ](與Thermo Fisher合作開發),同時,明確該儀器適用于來源于人體的血漿游離DNA樣本中的T790M突變進行檢測。標志著該儀器成為國內首個獲食藥監局批準上市的數字PCR芯片閱讀儀。(CFDA可查)

        2017年10月,順德永諾成功研發微滴式數字PCR儀MiniDrop?,系我國首款擁有完全自主知識產權的微滴式數字PCR儀,并投入生產。


        2017年10月31日,CFDA重慶市食品藥品監督管理局正式批準重慶泛生子生物科技有限公司的生物芯片閱讀儀(Digital PCR)——GENETRON 3D上市[ 渝械注準20172400136 ](與Thermo Fisher合作開發)。在已上市取得CFDA批準的數字PCR儀器中,泛生子GENETRON 3D適用范圍更加廣泛,且無配套試劑盒限定。(應該是地方二類注冊證,小編在CFDA沒有查到,僅在重慶食藥監局查到,如有錯誤請指正)


        dPCR法應用實例介紹

        實例1:比如現在有一名結直腸癌患者,手術后進行化療和靶向治療,想監測腫瘤的療效和復發。醫院由于病理科不愿意將組織樣本外送,在沒有腫瘤組織的情況下,如何檢測?如果采血使用ctDNA進行突變檢測,頻率低于1%的話,超出絕大部分已知方法的最低檢測限。此時需要進行精確定量分析,用于預判療效和復發風險,我們可以選擇用數字PCR進行檢測。(KRAS野生對西妥昔單抗/帕尼單抗敏感,突變則對西妥昔單抗/帕尼單抗耐藥)


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        兩次檢測,0.54%,0.58%均能檢出


        實例2:采用數字PCR對一例結直腸癌患者的療效和復發進行監控,術前通過數字PCR檢測有 KRAS G12A 突變,然后進行直腸切除術,術后進行了化療治療,一段時間后又進行數字PCR檢測,此時 KRAS G12A 突變消失,在第11個月后 KRAS G12A 突變出現,而且持續升高,在第12個月檢查發現肝轉移,然后進行肝切除術,數字PCR繼續監測,發現第16個月時候達最高峰,在第18個月檢查發現發生了肺轉移,此時化療聯合貝伐單抗進行治療,然后數字PCR繼續監測發現KRAS G12A 突變比例降低,后面繼續監測發現突變豐度穩定沒有發生其他部位轉移,可見數字PCR在動態監測中是個很好的方法。(只是個例技術介紹,不要在意個例中的突變及藥物,雖然KRAS突變可能對貝伐單抗耐藥,但證據等級達不到臨床證據等級)


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        數字PCR動態監測


        整個實驗主要操作步驟


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        dPCR檢測技術點評

        優點:

        1,靈敏度高,可檢測低至0.1%的突變;

        2,能夠進行絕對定量,不依賴對照品或標準品;

        3,操作過程簡單;

        4,結果分析簡單。


        缺點:

        1,通量較低(一管最高10重反應)

        2,需要特殊儀器設備;

        3,適用范圍較為單一;

        4,檢測成本較高。

        此方法適宜于對ctDNA或者其他低濃度樣本的低頻突變進行檢測,特別適用于“液體活檢”。




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